2020.9.10丨Pacbio技术三代建库、测序原理

zz/2024/4/28 8:14:35

基本概念：
- 第三代基因测序技术又被为“Single Molecule Real Time (SMRT™) DNA Sequencing”（单分子实时DNA测序技术），该方法基于纳米孔的单分子读取技术，不需要扩增即可快速读取序列。目前，Pacific Biosciences公司已经成功推出了商业化的第三代测序仪PacBio RS平台和PacBio Sequel平台
SMRT测序原理
- 步骤1：将磷酸化核苷酸引入零模波导孔（ZMW）
- 步骤2：核苷酸在检测体积中保持数十毫秒，当被光激发时发出荧光。捕获的光将转换为具有相关质量指标的基本呼叫
- 步骤3：聚合酶掺入核苷酸，释放出附着的染料分子
- 步骤4-5：重复该过程
SMRTbell™模板介绍：
- 结构线性
- 拓扑圆形
- 模板的结构同质性
- 提供相同序列的正向和反向链序列
测序优势
- 边合成边读取数据
  - PacBio SMRT技术采用了边合成边测序的思想，使用4色荧光标记碱基；
- 长读长
  - pacbio读长可以达到10Kb以上；其超长读长的关键在于使用了活性持久且高保真的DNA聚合酶，并以SMRT芯片为测序载体；可以减少拼接成本，节省内存和计算时间，可以用有限的覆盖度finishingGenome；
- DNA不需要扩增无GC偏好性
  - DNA建库整个过程，不存在PCR扩增的情况，不会引入PCR扩增引起的GC偏好问题，对打限度的保证了读取信息GC比例的准确性
DNA质量要求
- •必须为双链DNA（dsDNA）
- •避免反复冻溶，未经高温处理（>65°C）
- •DNA保存溶液pH在6-9之间，建议保存于弱酸性换环境；
- •OD260/280 在 1.8~2.0、OD260/230在2.0~2.2之间
- •澄清无色，无不溶物；
- •无RNA的污染；
- •DNA未接触过紫外、荧光燃料等可能损伤DNA 的环境和物质
- •不含螯合剂（如EDTA）、二价金属阳离子（如Mg2+）、变性剂（如胍盐，苯酚）、去污剂（如SDS、Triton-X100、CTAB）
- •DNA电泳条带单一，条带长度≥23kb，无明显降解
- •Qubit 浓度: Nanodrop 浓度≥0.5（最好接近 1）
RNA质量要求
- •浓度>300ng/ul
- •完整性：RIN值≥8.0；28S/18S>1；基线无上抬或轻微上抬；5S峰正常；
- •纯度：1.7 <OD260/280<2.2；OD260/230>0.5；260吸收峰正常不偏移;
- •样品状态：送样粘稠、颜色异常、有浑浊或不溶物均不合格；
- •电泳：无基因组污染；
- •样品运送前保存在-80℃冰箱；
合成工作流
- 合成图
- 建库流程图
  - 合成cDNA
  - 片段分区，PCR扩增
  - SMRTbell™ 成环
  - PacBio® RS II 测序
  - 数据分析
    - 原始数据
    - 清洁数据
    - 聚类
    - 生成转录本
    - 质量过滤
测序应用
- （1）全基因组denovo测序
- （2）基因组草图的优化或基因组完成图绘制
- （3）全长转录本测序
- （4）宏基因组测序
- （5）16SrDNA全长测序
- （6）细胞器基因组测序
- （7）全基因组重测序&稀有变异鉴定
- （8）表观遗传学

http://www.ngui.cc/zz/2177399.html

2020.9.10丨Pacbio技术三代建库、测序原理

相关文章

文献翻译：Genomic features of bacterial adaptation to plants

QIIME2 学习笔记 （一）

从宏基因组序列中提取16S序列

16S多样性ASV分析-低氧区ODZ水层分析

16S多样性测序，到底该选啥引物？！

生物信息学Bioinformatics学习笔记（四）- Data analysis-16sRNA

16s rDNA数据分析经验总结

16S rdna 菌种鉴定

16S rRNArDNA测序分析

16S rDNA分析中的qiime脚本

QIIME2 学习笔记（一）